经典应用多光子显微镜
显微术发展到今天呈现给我们的是实验室陈列的形形色色显微系统，科学研究越来越离不开这些工具，但真正用好着实需要下一番功夫。接下来我将与各位分享一个精确、精美及精深多光子图片背后那个卓越多光子系统如何成像的故事。
正所谓“尺有所短寸有所长”，没有真正意义上的万能显微镜能够帮助我们开展所有的研究工作。真正需要用到哪款显微镜还得看我们想要做什么！假若您准备了一个带荧光的活体组织样品，想要做深层荧光成像，我想双光子显微镜会很适合您。这也是我们往往选择用多光子显微系统的第一动因。这里提到了荧光成像，作为时下最为广泛的研究手段其重要性我们从08年钱永健等三位诺奖得主的研究工作就能体会到。历经几年的发展，对荧光成像的玩法也发展的越来越多，利用多光子显微系统进行活体组织荧光成像必定一个炙手可热的方向。
什么是多光子成像？多光子显微镜常称作非线性、双光子激光扫描显微镜，是建立在先进的超快脉冲激光扫描技术基础上的显微镜实验方法，在更深入的层面上提供了更优秀的光学切片能力。70年前 Maria Göppert-Mayer 第一次阐述了多光子激发的基本原理，但是该假设直到30 年后脉冲红宝石激光发明后才被证明。在高光子密度条件下，两个光子可以同时（10-18秒以内）被吸收，使荧光团中的电子跃迁到高能级激发态，再发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子荧光激发方法使用穿透性强的长波红光或近红外光，对活性标本的杀伤极小，因此非常适用于活细胞成像，尤其是厚的活组织如脑片、胚胎、整个器官甚至整个机体的成像研究。
一套优异的多光子成像系统应该具备怎样的特性呢？
Olympus提供的FV1200 MPE告诉我们：活体组织成像最深是第一品质。如右图，RIKEN Brain Science Institute对标记YFP的8周小鼠大脑活体成像，我们看到了从cortical surface到海马CA1区的1.3mm荧光图像。实验方法是将小鼠麻醉后进行开颅，再利用FV1200 MPE进行成像。如果我们经历过类似的手段进行实验就知道一般多光子成像系统往往只能看到0.8mm，样品极佳的状态下实现1mm也是鲜有的。主要双光子激发效率低的缘故，FV1200 MPE是如何做到1.3mm活体成像的呢？
一般来说，不能看的深实质是在深层图像获取时不能采集到足够的荧光信号。FV1200 MPE能够实现最大效率的荧光激发与检测，也就延伸到其他多光子系统所不能涉及的区域。
最大效率的荧光激发具体来说是FV1200 MPE缜密的光路系统（Negative Chirp System与高透过率光学元件等）让锐利的脉冲IR激光达到样品时依然保持其“风（峰）度”，高效荧光激发油然而生。另外一个实现高效荧光激发是由FV1200 MPE特有的25X 双光子专用镜头（XLPLN25XWMP）实现的。生物活体样品有一个特点我们必须了解：细胞中存在很多囊泡、脂质体等等折射率不同的亚细胞结构，这些结构在显微成像中充当了一个个特殊透镜，IR激光经过这些透镜之后会发生很大的球差，通俗来说就是IR激光不能够完美汇聚到焦点，激发效率自然就下降了。那么这款专用镜头是怎么改变这一现状的呢？校正环！0-2mm可调，矫正不同深度球差，IR激光能量更集中，带来的是更多荧光素被激发！除了以上提到的两点，其他因素还有很多，比如FV1200MPE特有的自动开普勒透镜能够让IR激光充满整个物镜出瞳面等。
多光子成像时只有焦点位置的荧光素能够被激发，我们可能会想，把这部分激发出来的荧光信号都给采集了不就可以了吗？可事实并不是那么简单，上面提到的生物样品里面一个个“小透镜”同样扮演着非常重要的角色。它们焦点发射的荧光不断的折射…折射…这些活泼的荧光就很难被完全采集到了。本来就很低的多光子激发，这样一来，荧光信号会更低。
FV1200MPE在多光子采集方面做了很多特殊而又有成效的设计。从源头出发，怎么解决光散射问题？FV1200MPE告诉我们超大收集视场数物镜（XLPLN25XWMP FN 27.5）能最大程度获取荧光信号。因为不管荧光如何散射都是焦点发出的，搜集到的信号都是我们所需要的。当我们把所有的荧光信号都搜集起来，发现荧光信号同单光子（共聚焦）比起来还是弱很多。怎么办？检测光路的光程和整个光路的透过率就显得尤为重要了。FV1200MPE的设计是在距离标本最近的位置安装了对称式设计的PMT检测器，保证荧光信号尽可能少的穿过透镜，并且保证每个PMT获取荧光效率是一致的。同时，对于必须穿过的透镜均采用特殊镀膜技术，实现最大的荧光透过率。以及专有的对称式PMT检测器设计，实现每个荧光通道的检测效率都是相当的。最令人称赞的是超高灵敏度检测器（GaAsp），其优异表现的量子效率（45%），可在极弱光条件下依然获得高性噪比图像。如此高效的检测系统就算在达到1mm以上依然能够获取理想的荧光图片。
以上的这些设计赋予了FV1200MPE最深的多光子成像，我们可以把每一层图片拍的很漂亮，甚至拓展到多维XYZ/T/Multi-area等。现代生命科学研究问我们研究者是否能够提供更直观的高维图片？能否有统计结果？结果可靠性？来个Movie？等等，当我们拿到多维图片后会想到后期数据如何分析呢？我想FV1200MPE系统提供的Imaris多维图像分析软件能够给您答案！Imaris具体如何工作请参阅另一板块。
FV1200MPE还能够做哪些工作呢？可能您想问这个问题，除了上面提到的多光子成像，我想说这套系统可以完成单光子成像、单光子光刺激、多光子光刺激、SHG成像、4mm/8mm多光子成像等等功能。具体如何实现我们将在后期主题中进行讨论。
我讲的这些更偏重于多光子技术层面的知识，各位可能面临更多的问题还是与自己息息相关的不同应用方向的问题，不妨留言给我们一起来探讨解决。
文中图片均来自：Hiroshi Hama, Hiroshi Kurokawa, Atsushi Miyawaki
Laboratory for Cell Function Dynamics, RIKEN Brain Science Institute
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